编译：微科盟煎蛋

编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文

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导读  

多重耐药(MDR)铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)是一种致死性革兰氏阴性病原体，可引起难治的医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎。作者前期的研究证实，黄芩苷是黄芩中重要的生物活性成分，在多重耐药铜绿假单胞菌诱导的急性肺炎大鼠模型中表现出抗炎作用。然而，黄芩苷的这种作用与其低生物利用度相反，其作用机制仍然未知。因此，本研究通过对大鼠粪便16S rRNA基因的焦磷酸测序和代谢组学研究黄芩苷对多重耐药铜绿假单胞菌急性肺炎的治疗效果是否与调节肠道微生物群及其代谢物有关。结果表明，黄芩苷通过直接作用于中性粒细胞来减轻炎症，并调节炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的产生。其机制是通过下调TLR4和抑制NF-κB。此外，大鼠粪便中16S rRNA基因的焦磷酸测序揭示了黄芩苷调节肠道微生物群落的组成。在属水平上，黄芩苷有效增加了Ligilactobacillus、乳杆菌和拟杆菌的丰度，降低了Muribaculaceae和Alistipes的丰度。此外，通过预测肠道菌群功能和靶向代谢组学，发现精氨酸生物合成是黄芩苷调控的核心途径。综上所述，本研究表明，黄芩苷通过与肠道微生物群相关的精氨酸生物合成减轻了多重耐药铜绿假单胞菌诱导的急性肺炎大鼠的炎症损伤。黄芩苷是治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染引起的肺部炎症的有效辅助药物。

论文ID

原名：Baicalin ameliorates multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa induced pulmonary inflammation in rat via arginine biosynthesis

译名：黄芩苷通过精氨酸生物合成改善多重耐药铜绿假单胞菌诱导的大鼠肺部炎症

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

IF：7.419

发表时间：2023.4

通讯作者：王成祥，崔鹤蓉，雷海民

通讯作者单位：北京中医药大学第三附属医院；北京中医药大学生命科学学院；北京中医药大学中药学院

DOI号：10.1016/j.biopha.2023.114660

实验设计

结果

1黄芩苷对多重耐药铜绿假单胞菌感染大鼠急性肺炎的影响

通过体重(BW)、全血Hemameba和NEUT以及组织病理学评估黄芩苷对多重耐药铜绿假单胞菌感染大鼠急性肺炎的治疗效果。与对照大鼠的BW相比，多重耐药铜绿假单胞菌感染大鼠的BW增加缓慢，给药后有一些恢复。值得注意的是，与对照大鼠相比，感染多重耐药铜绿假单胞菌的大鼠在感染后第7天的BW较低(P < 0.05)。特治星或黄芩苷(0.182、0.364和0.728g/kg/天)对感染引起的体重下降有抑制作用(P < 0.05)(图1A和补充材料表S1)。与对照组相比，模型组大鼠全血Hemameba水平显著升高(P < 0.05)。与模型组相比，特治星或黄芩苷组大鼠全血Hemameba水平降低(0.182、0.364和0.728 g/kg/天)，差异有统计学意义(P < 0.05)(图1B和补充材料表S2)。与对照组相比，模型组全血NEUT水平显著升高(P < 0.05)。与模型组相比，特治星和黄芩苷组大鼠全血NEUT水平降低(0.182、0.364和0.728 g/kg/天)，差异有统计学意义(P < 0.05)。(图1C和补充材料表S3)。此外，与对照组相比，模型组表现出严重的炎症细胞浸润，肺泡壁明显增厚，肺泡部分固结。与模型组大鼠相比，3个黄芩苷处理组(0.182、0.364和0.728 g/kg/天)大鼠的上述组织病理学指标均有改善，且均呈剂量依赖性。黄芩苷组和特治星组的病理变化减少(图1D)。此外，细菌负荷检测表明，黄芩苷(0.728 g/kg/天)显著降低了多重耐药铜绿假单胞菌在肺部的定植(补充材料表S4)。综上所述，这些结果表明黄芩苷可显著减轻多重耐药铜绿假单胞菌感染大鼠的肺病理改变和肺部炎症。

(A)体重(g)，(B)全血Hemameba，(C)全血NEUT，(D)肺组织的H&E。C和Con代表对照组，M和Mod代表模型组，P和Pos代表阳性组，H1代表黄芩苷(0.182 g/kg/天)组，H2代表黄芩苷(0.364 g/kg/天)组，H3代表黄芩苷(0.728 g/kg/天)组，使用方差分析及事后检验来计算差异的显著性，与模型组相比：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。结果表示为平均值±7标准偏差。

2黄芩苷抑制肺组织炎症 2.1 血清和肺匀浆中IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10水平

多重耐药铜绿假单胞菌感染导致肺部炎症浸润过多和损伤。在这一病理过程中，机体分泌大量的炎症因子进行一系列的细胞过程，从而产生强烈的炎症反应。促炎介质(IL-6、IL-1β、TNF-α)和抗炎介质(IL-10)在多重耐药铜绿假单胞菌感染引起的过度炎症的发展中起重要作用。在大鼠血清中，与对照组相比，模型组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高(P < 0.05)。与模型组相比，黄芩苷和特治星组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组相比，模型组大鼠血清IL-10水平显著下降(P < 0.05)。与模型组相比，黄芩苷组和特治星组大鼠血清IL-10水平升高，差异有统计学意义(P < 0.05)(图2A-D及补充材料表S5)。肺匀浆结果与血清结果的趋势相似(图2E-H和补充材料表S6)。

(A-D)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。(E-H)肺匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。C代表对照组，M代表模型组，P代表阳性组，H3代表黄芩苷(0.728 g/kg/天)组，使用方差分析及事后检验来计算差异的显著性，与模型组相比：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。结果表示为平均值± 标准偏差。

2.2肺组织中TLR4和NF-κB的mRNA和蛋白表达

TLR4/NF-κB炎性小体通路与IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10密切相关。因此，我们接下来研究了TLR4/NF-κB炎性小体通路是否参与黄芩苷依赖性炎症细胞因子的调节。与对照组相比，模型组大鼠肺组织中TLR4和NF-κB的mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)。与模型组相比，黄芩苷和特治星处理组大鼠肺组织中TLR4和NF-κB的mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)(图3A-B和补充材料表S7)。

为了进一步验证黄芩苷的抗炎作用是否是通过抑制TLR4/NF-κB炎性小体通路，作者检测了TLR4和NF-κB的蛋白表达水平。首先，研究人员对大鼠的肺组织进行了WB分析。结果显示，与对照组相比，模型大鼠肺组织中TLR4和NF-κB蛋白的表达增加(P < 0.05)。黄芩苷和特治星处理组大鼠肺组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达与模型组相比显著降低(P < 0.05)(图3C-E和补充材料表S8)。免疫组织化学分析的结果与WB分析结果一致(图3 F)。本研究的结果表明，黄芩苷治疗可以抑制多重耐药铜绿假单胞菌在大鼠中诱导的过度炎症反应，并与TLR4/NF-κB炎性小体通路的抑制有关。

(A-B)肺组织中TLR4和NF-κB的mRNA表达。(C-E) WB检测肺组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达。(F) IHC检测肺组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达。C代表对照组，M代表模型组，P代表阳性组，H3代表黄芩苷(0.728 g/kg/天)组，使用方差分析及事后检验来计算差异的显著性，与模型组相比：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。结果表示为平均值± 标准偏差。

3黄芩苷调节急性肺炎大鼠肠道微生物群

通过分析对照组、模型组和黄芩苷组大鼠结肠分离的微生物样品的16S rRNA基因序列，研究了黄芩苷对急性肺炎大鼠肠道菌群整体结构变化的影响。基于未加权UniFrac方法的主坐标分析(PCoA)用于评估来自不同治疗组的肠道微生物群的单独聚类。结果表明，对照组与模型组明显分离。然而，对照组与黄芩苷组之间的聚类距离比对照组和模型组之间的距离更近(图4A)。与对照组相比，模型组大鼠肠道菌群的丰富度(Chao1指数)和多样性(Shannon指数)显著降低。而与模型组相比，黄芩苷处理显著提高了Chao1指数和Shannon指数(图4B-C，P < 0.05)。黄芩苷调节肠道微生物群落的组成。在属水平上，与对照组相比，模型组显著增加了Muribaculaceae和Alistipes的丰度，而降低了Ligilactobacillus、乳杆菌属(Lactobacillus)和拟杆菌属(Bacteroides)的丰度。然而，黄芩苷处理逆转了这些变化(图4D-G)。

(A) PCoA得分图。(B) Chao1指数。(C) Shannon指数。(D)肠道微生物群的分支图。(E)属水平微生物群落最丰富的5个属。(F-G)属水平微生物群落丰度前30的微生物。C代表对照组，M代表模型组，H3代表黄芩苷(0.728 g/kg/天)组。

4黄芩苷调节急性肺炎大鼠代谢产物

采用UPLC-QTOF-MS非靶向代谢组学分析黄芩苷的主要作用机制。采用阳离子模式进行样品分析。对所得代谢物建立PCA和OPLS-DA模型。结果(图5)显示，QC样品聚集在评分矩阵投影的中间，表明分析系统的稳定性；每一组都能很好地分离，表明样品的代谢环境发生了变化。模型判别R2Y=0.952，模型预测能力Q2Y=0.873，说明拟合模型的精度和预测性能较好。在此基础上，采用s图分析了OPLS Da模型的微分变量，得出|P(CORR)| ≥ 0.58、VIP > 1和P < 0.05，倍数变化 > 1.5或< 0.5被确定为候选标志物。使用METLIN数据库和KEGG数据库来识别和预测候选标志物和关键代谢途径。结果表明，黄芩苷主要影响精氨酸生物合成(P < 0.05)。使用靶向代谢组学共鉴定出29种显著变化的生物标志物(表1)，包括L-精氨酸和庚基酮等，表明黄芩苷对精氨酸生物合成(P < 0.05)(表2)有显著影响。精氨酸及其代谢物可能抑制促炎因子的释放，并且已知与炎症反应密切相关。

(A)归一化前后实验样本的浮点值。(B)归一化前后的箱图和核密度图。由于空间限制，方框图最多显示50个功能。密度图基于所有样本。(C) ESI中PCA的对照和PR得分图+ PC1与PC2的模式。(绿色：对照组；红色：黄芩苷组；蓝色：模型组)。(D) ESI数据的OPLS-DA分析+ 模式(绿色：对照组；红色：黄芩苷组；蓝色：黄芩苷组)。(E)模型组和黄芩苷组OPLS-DA模型的S图。红点表示已识别的生物标志物。1代表对照组，2代表模型组，3代表黄芩苷(0.728 g/kg/天)组。

表1. 模型组和黄芩苷组之间的代谢物发生了显著变化。

表2. 黄芩苷调节代谢途径的改变。

5相关分析揭示黄芩苷对精氨酸生物合成的调控

PICRUSt2软件包基于16S标记数据进行功能预测，预测KEGG通路的丰度。以下差异通路受黄芩苷的影响，包括N10-甲酰基-四氢叶酸生物合成、4-羟基苯乙酸降解、分支酸代谢超通路、同乳酸发酵、糖酵解III(来自葡萄糖)、精氨酸和多胺生物合成超通路，L-精氨酸、腐胺和4-氨基丁酸降解超通路，精氨酸、鸟氨酸和脯氨酸相互转化，L-精氨酸生物合成I(通过L-鸟氨酸)、L-精氨酸生物合成II(乙酰循环)。这些来自16S数据的功能预测结果与代谢组学的结果一致。综上所述，相关分析表明，受黄芩苷影响的主要差异通路是精氨酸生物合成，这是黄芩苷调控的核心途径。具体调控机制如图6所示。

讨论

细菌感染本身可引发肺损伤，宿主防御反应导致炎症加重和进一步的肺损伤。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的一个组成部分。Toll样受体4(TLR4)是识别病原体相关分子模式的主要传感器。LPS刺激的TLR4可以激活核因子κB(NF-κB)，诱导编码促炎细胞因子的基因转录，这在免疫和炎症调节中起关键作用。强烈的炎症反应虽然对铜绿假单胞菌清除至关重要，但需要快速抑制，以限制组织损伤。最近的几项研究表明，血管紧张素转换酶2、大麻素-2受体激活和a-生育酚是调节肺部铜绿假单胞菌感染的有害高炎症反应的有力治疗策略。鉴于黄芩苷的抗炎特性，它可能是治疗感染相关炎症的有希望的候选治疗药物，但其临床安全性和有效性仍有待进一步研究。在本研究中，证明了黄芩苷通过直接作用于中性粒细胞来减轻炎症，并抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的产生。黄芩苷抗炎作用的分子机制包括下调TLR4和抑制NF-κB对多重耐药铜绿假单胞菌诱导的急性肺炎大鼠模型的作用。这些数据表明，黄芩苷通过抑制TLR4/NF-κB通路，有助于改善多重耐药铜绿假单胞菌诱导的肺炎大鼠模型。据观察，黄芩苷治疗会引起轻微的胃肠道反应，如厌食、恶心、呕吐、腹泻、便秘和肠胃胀气。然而，黄芩苷在大多数动物研究和临床试验中显示出低毒性，对人体的副作用和长期毒性试验仍缺乏。基于以上考虑，在今后的临床应用中，胃肠道不适的患者应谨慎用药。

黄芩苷的抗炎作用明显，但其生物利用度较低。生物利用度差的天然产物介导的益处可能通过调节微生物种群而发生。肠道菌群主要通过肠道微生物酶催化的代谢改变、宿主基因表达的调节、底物竞争和影响肠道性质等途径来影响口服药物的生物利用度。某些药物可改变肠道菌群的组成，进而影响口服药物的生物利用度。近年来，越来越多的研究调查了肠道微生物群与草药(HMs)之间的相互作用。例如，动物和临床研究都证明BBR通过改变肠道微生物群对2型糖尿病、肥胖症、帕金森病等疾病有良好的治疗作用。此外，肠道中微生物组成和功能的变化(称为微生态失调)最近与肺部疾病的发展有关。

因此，作者从肠道微生物群的角度研究了细菌抗炎作用背后的机制。许多研究表明，有益的肠道微生物群，如乳杆菌、Akkermansia muchiniphila和芽孢杆菌，对不健康的宿主具有抗炎作用。例如，在肺炎克雷伯菌诱导的肺部感染小鼠中，给予益生菌长双歧杆菌51A（Bifidobacterium longum51A），通过微调炎症反应并有助于更快地恢复肺部稳态，从而保护宿主免受肺炎引起的死亡。在本研究中，通过16S rRNA测序比较每组小鼠的肠道微生物组成，揭示了黄芩苷治疗调节了多重耐药铜绿假单胞菌诱导的急性肺炎大鼠肠道微生物群落的组成。在属水平上，黄芩苷有效提高了Ligilactobacillus、乳杆菌和拟杆菌的丰度，但降低了Muribaculaceae和Alistipes的丰度。在受黄芩苷显著调控的细菌中，Ligilactobacillus、乳杆菌和拟杆菌与抗炎呈正相关。值得注意的是，据报道，肠道共生微生物脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)可以作为黄芩苷的靶点，减轻Mycoplasma gallisepticum感染介导的肺部炎症损伤。这些数据表明，用黄芩苷治疗的多重耐药铜绿假单胞菌诱导的急性肺炎模型大鼠肠道微生物群的组成转向有益微生物种群的富集。越来越多的证据表明，共生肠道菌群的特定成员对全身免疫(包括肺部)的影响，以及益生菌和益生元用于预防和治疗急性肺部疾病。

肠道菌群的全身效应部分归因于其产生的代谢物，包括SCFA，可通过激活G蛋白偶联受体来抑制肺部炎症。据报道，铜绿假单胞菌降低了肺炎小鼠肠道微生物群的多样性和数量，导致代谢紊乱。同时，粪便微生物群移植通过调节肠道微生物群紊乱和代谢紊乱来改善铜绿假单胞菌肺炎小鼠的炎症和肺损伤。因此，本研究通过对16S数据的功能预测进一步研究了黄芩苷调控的肠道微生物群相关代谢组学途径。结果发现，包括精氨酸生物合成在内的前10个差异通路与黄芩苷影响的肠道微生物群的变化有关。此外，靶向代谢组学分析揭示了黄芩苷处理小鼠精氨酸水平的显著变化。综上所述，相关分析表明，受黄芩苷影响的主要差异通路是精氨酸生物合成，这是黄芩苷调控的核心通路。L-精氨酸是一种半必需氨基酸，参与许多生物过程。精氨酸及其代谢物可能抑制促炎因子的分泌，并且已知与炎症反应密切相关。据报道，代谢物与促炎细胞因子/趋化因子(如IL-6和IL-1β)之间存在紧密关联，并暗示精氨酸、色氨酸、嘌呤代谢与COVID-19患者的高炎症之间存在潜在的调节干扰。此外，他们还证明，靶向代谢显著调节从感染SARS-CoV-2的恒河猴离体分离的外周血单核细胞释放的促炎细胞因子。值得注意的是，一项研究表明，L-精氨酸诱导的肠道微生物群通过富集B. pseudolongum在体内驱动保护性肠-肺轴，增强了肺部对非结核分枝杆菌感染的免疫防御。本研究通过相关分析发现，黄芩苷影响的主要差异途径是精氨酸生物合成，是黄芩苷在肺炎多重耐药铜绿假单胞菌引起的大鼠炎症损伤中调控的核心途径。这与精氨酸在感染性肺部疾病中协调免疫和炎症反应的报道一致。

综上所述，本研究表明黄芩苷通过与肠道微生物群相关的精氨酸生物合成缓解了多重耐药铜绿假单胞菌诱导的急性肺炎大鼠的炎症损伤，这可能是一种有前景且有效的临床辅助治疗方法。

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